胶体金的制备

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根据不同的制备方法,可以制备出直径1-500nm的胶体金粒子,但做为免疫标记探针,其直径应在3-30nm范围内。
    在氯化金(HAuCl4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂,可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每减少一倍,数量增加为原来的8倍。

1、以柠檬酸钠/单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径3~16nm的胶体金。

(1)  取一250 ml三角瓶,加入79 ml双蒸水和1 ml 1%氯化金,预热至60~70℃。
(2)  取一50 ml烧杯,加入4 ml 1%柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60~70℃。K2CO3的作用是保持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时,对pH的影响不大,K2CO3可以省略。
(3)  将上两种溶液迅速混合并充分混匀,加热至沸并保温10分钟。自然冷却。
 
柠檬酸钠(ml)  单宁酸(ml)  胶体金(nm)
       4                       5000                    3
       4                       2000                    4
       4                       500                      6
       4                       120                      8
       4                        70                      10
       4                        10                      16
     
一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄,而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1~0.2%的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。

2、柠檬酸三钠法制备12-30 nm胶体金(Frens, 1973)
(1)  取250 ml三角瓶一个,加100 ml双蒸水及1 ml 1%氯化金,加热沸腾;
(2)  取不同量的1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀,再保持沸腾30 min,溶液颜色首先变黑,再逐渐变红,粒子体积较小时,溶液呈桔红色,而粒子体积较大时,则颜色偏向紫色。

注 意:
(1)  由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差,以及制备过程中的其它问题,胶体金粒子的大小及一致性与理论值可能有偏差,因此,在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太大,粒子凝聚,粒子边缘不清晰等问题,须重新制备。
(2)  胶体金溶液最好保存在4℃冰箱中;也可保存在室温下,一般可保存1-2个月。但决不可保存在0℃以下,否则金粒子发生凝聚。
利用柠檬酸为还原剂,可以制备12~150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时,胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。 

    氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(0.5g或1g),因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存(-20℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时,烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用0.22 mm微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。
    制备好的胶体金保存寿命较长,可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。
 

    除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金,它避免了单宁酸残基的问题,但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理,故该方法已经很少使用。
3、白磷还原法制备5 nm胶体金
(1)  取250 ml三角瓶一个,加79 ml双蒸水,1 ml 1%氯化金,并用0.25 M K2CO3将溶液调至中性(pH7.0)。
(2)  取0.2 ml饱和磷/乙醚溶液加到1.5 ml试管中,再加0.8 ml乙醚,混匀。取0.7 ml加入溶液(1)中(磷有毒且易燃,操作请带手套,多余的磷溶液用CuSO4进行中和)。
(3)  室温下轻轻摇匀15 min,然后加热沸腾并保持5 min,自然冷却。

2018年9月2日 15:47
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