蛋白-金 复合体的制备

一般认为胶体金粒子表面为一层AuCl2，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。

金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于pH值，这是因为蛋白的净电荷取决于溶液的pH值，在pH=pI 时为中性。当pH=pI 时蛋白溶解度最小，水化程度最小，最容易吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备中，一般胶体金调整为pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。

胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（1）去除高浓度的盐分。高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析。（3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30 kD），形成的蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性无影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。   

当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳pH值。对于理化性质不确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同pH值的胶体金结合后，只有某一特定pH值能够形成结合最稳定的探针。在高浓度电解质（如NaCl）作用下不会凝聚。不同蛋白的适宜pH范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜pH值为最佳pH值。但有些探针的实际情况并不完全如此，最稳定探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。
在确定最佳pH值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。如果在制备探针时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重的是容易造成探针凝聚，并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭”（Blocking）作用，而胶体金探针标记不上。在标记位点稀少、被标记物含量较少的情况下要特别注意。 

这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最佳pH也有一定变化。
因此，在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。 

1、抗血清的前处理

一般抗血清中IgG的含量为10-25%，而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探针其标记活性与特异性均不理想。因此需去除其中多数杂蛋白。但处理环节不宜太繁，在实验室设备与经验缺乏的情况下更是如此，否则会导致IgG活性的大幅降低。如果你的实验室在蛋白纯化方面有很强的技术支持，高度纯化后效果会更好。

大量工作表明，只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的IgG蛋白。其基本步骤如下：

(1)  取抗血清0.2 ml；

(2)  加生理盐水（0.85％ NaCl）0.3 ml，混匀；

(3)  逐滴加入饱和 (NH4)2SO4 0.5 ml，充分振荡混匀，4℃静置1 h；

(4)  10000 rpm/min离心20 min，弃上清；

(5)  加0.5 ml生理盐水重悬浮，混匀；
(6)  逐滴加0.25 ml饱和 (NH4)2SO4，充分振荡混匀，4℃静置1 h；

(7)  10000 rpm/min离心20 min，弃上清；

(8)  重复5～8步骤一次；

(9)  加生理盐水0.5 ml重悬浮，混匀；

(10)  生理盐水中透析12～24 h；

(11)  在0.2 M pH 9.0硼酸缓冲液透析12～24 h；

(12)  分装，即将使用时4℃保存，备用-20℃保存。

为最大限度保持抗体活性，整个过程应在4℃下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生理盐水透析改为3 M KCNS透析，促使聚合的多聚体解聚。如果抗血清效价较低时，不宜制备胶体金探针。
 

2、亲和纯化抗体的处理

亲和纯化抗体多是一些商品化的通用抗体，即二抗。一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人的抗体。这些抗体一般有两个问题，一是IgG分子往往聚集为多聚体分子，二是往往含有较多的盐分。因此前处理的目的在于脱盐和解聚。

其基本步骤如下：

(1)  将亲和纯化抗体用生理盐水稀释为0.5-1 mg/ml浓度

(2)  在3 M KCNS（硫氰酸钾）溶液中透析12 h

(3)  在2 mMol pH 9.0的硼酸缓冲液中透析12 h（更换透析液数次）

(4)  分装备用

其它蛋白可参考此方法进行。但注意后一种透析液的pH值应与交联时pH值一致。在实际运用中，一般省略去3M KCNS透析这一步，特别是当蛋白分子量较小，且为非糖蛋白时。我们建议在制备通用探针（如二抗IgG，Protein A，Protein G，Streptavidin）等时，严格使用该方法，而制备直接标记探针时，也可以忽略处理步骤。
 

3、IgG Fab片段的制备

一般来说体积较小的探针具有相对较高的标记活性。主要原因在于胶体金颗粒较小时有利于在标记溶液中的扩散运动；在胶体金直径一定时，蛋白分子量越小，金表面吸附的蛋白分子越多，活性位点也越密集，也容易与靶位点结合。

IgG分子量为150 kD左右，由4个亚基组成，即两条重链（H）和两条轻链（L）。用水解酶（木瓜蛋白酶）水解后可得到两种片段，即Fab和Fc。其中Fab是具有抗原识别活性的部分，回收后制备探针。Fc能够与Protein A和Protein G特异性结合。但这种分离只能在有条件的实验室进行。

其基本过程如下：

(1)  用PBS（pH 7.0，含10 mM EDTA，20 mM盐酸半胱氨酸）溶解纯化的IgG

(2)  加固化木瓜蛋白酶

(3)  37℃处理5h

(4)  离心，去除固化木瓜蛋白酶（沉淀）

(5)  过Protein G柱

(6)  纯化的Fab片段按前面方法做进一步处理

注：Fab与胶体金结合的pH值为6.5
 

4、蛋白与胶体金结合最佳pH测定

(例纤维素酶，pI未知)

(1)  取若干个1.5ml试管，分别加入1 ml 10 nm胶体金；

(2)  用25 mM K2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；

(3)  取一96孔培养板，按pH从低到高分别将上述胶体金分别取100 ul加入孔中，重复三次；

(4)  每孔分别加入3 ul浓度为1 mg/ml的纤维素酶，混合，室温下放置10-15 min；

(5)  每孔分别加入20 ul浓度为10％ NaCl溶液，混合，室温下放置10 min；

(6)  观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH(X)；

(7)  重复(1)-(5)步，pH梯度为X-0.6；X-0.3；X；X+0.3；X+0.6；X+1。

(8) 观察胶体金颜色变化直到室温下放置2小时，记录仍保持红色的最低pH。

注意：

1．如胶体金粒子直径较小（3～6nm），加NaCl需放置较长时间（几个甚至十几个小时）后才能观察到颜色变化。必要时可放大反应体积（1 ml胶体金），并借助离心来判断。

2．有些蛋白最佳pH范围较窄，设置的梯度不能太大。

5、最小蛋白浓度的确定

(1)  用0.22 um微孔滤膜过滤或高速离心去除蛋白中残物或多聚体；

(2)  取一96孔滴定板，每个重复为若干个孔，分别加入最佳pH的胶体金100 ul，重复3次；

(3)  各孔依次加入不同量的蛋白（一般浓度为0.05-0.1 mg/ml）1～20 ul，混匀，室温下放置15min；

(4)  加入20 ul 10％ NaCl，室温下放置10min；

(5)  颜色仍保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白浓度。

(6)  为确保结果准确性，可放大反应体积重复以上步骤。

注：在实际探针制备工作中，蛋白浓度往往为最小浓度的130％。

6、IgG-gold的制备

(1)  取两个1.5 ml试管，分别加入1.2 ml 10 nm胶体金；

(2)  加入适量25 mM K2CO3把pH调整为9.0；

(3)  分别加入10 ul浓度为1 mg/ml IgG，混匀，室温放置10min；

(4)  分别加入12 ul 2% PEG20000，室温放置5 min；

(5)  10000 rpm离心20 min，轻轻吸除上清；

(6)  用BL溶液重悬浮松散的胶体金沉淀，并集中到新管中；

(7)  分别加甘油，充分混匀；

(8) -20℃保存备用。

注意：

1).不同直径胶体金所需要的蛋白量差别很大；

2).不同直径胶体金所需离心速度完全不同。以绝大部分探针形成松散沉淀为原则。离心力太大，会产生不可逆的探针凝聚；离心力太小，探针无法沉下。最好能够直接用胶体金在不同转速下离心以确定适当的离心力。

3).在冷离心机中可适当延长离心时间，同时适当减小离心力，探针活性较好。